PEWARNAAN DIFERENSIAL: PEWARNAAN GRAM

Latar Belakang Pewarnaan Gram

Pewarnaan diferensial merupakan metode pewarnaan yang membedakan macam sel melalui perbedaan warna. Prosedur pewarnaan diferensial yang digunakan di dalam pewarnaan bakteri adalah Pewarnaan Gram.

Pewarnaan Gram dikembangkan oleh Christian Gram pada tahun 1884 dan dimodifikasi oleh Hucker pada tahun 1921. Pewarnaan Gram memisahkan bakteri ke dalam dua kelompok:

(1) Bakteri gram positif yang mempertahankan zat warna utama (kristal violet) dan

(2) Bakteri gram negatif yang menyerap warna dari counterstain/pewarna penutup (biasanya safranin O).

Perbedaan hasil dari pewarnaan ini disebabkan oleh perbedaan struktur dinding sel antara kedua kelompok tersebut. Pewarna kristal violet pada awalnya diserap oleh kedua kelompok tersebut. Langkah berikutnya, larutan iodin sebagai penguat, menstabilkan kristal violet ke dalam lapisan peptidoglikan dinding sel. Lapisan peptidoglikan pada dinding sel bakteri gram positif lebih tebal dibanding pada gram negatif. Pada bakteri gram positif, peptidoglikan yang tebal terdapat pada bagian terluar menyelubungi membran sitoplasma, sedangkan pada bakteri gram negatif lapisan peptidoglikan dilapisi lagi oleh membran luar yang banyak mengandung lipida. Oleh karena itu, pewarna kristal violet terkurung lebih banyak di dalam peptidoglikan bakteri gram positif.

Langkah yang ketiga yaitu pelunturan pewarna utama dengan alkohol. Alkohol memecah lipida pada membran luar bakteri gram negatif dan mengeluarkan kristal violet dari lapisan peptidoglikan. Setelah langkah alkohol, hanya bakteri gram negatif yang dapat menerima safranin sebagai pewarna penutup.

Diagram skematik dinding sel bakteri gram positif (a) dan bakteri gram negatif (b). Foto pewarnaan gram di tengah menunjukkan sel Staphylococcus aureus (ungu, gram positif) dan Escherichia coli (merah muda, gram negatif). (gambar dari: Madigan MT, Martinko JM, Stahl DA, dan Clark DP. 2012. Brock Biology of Microorganisms, 13th ed. Pearson Education. San Francisco.)

Carbol-fuchsin dan basic-fuchsin kadang-kadang ditambahkan di dalam pewarna penutup untuk mewarnai bakteri anaerob dan sebagai penguat safranin bagi bakteri gram negatif lain yang lemah menyerap safranin (termasuk Legionella spp., Campylobacter spp., dan Brucella spp.).

Kesalahan yang terjadi dalam pewarnaan gram sering disebabkan karena preparasi bakteri pada gelas objek yang tebal, fiksasi yang terlalu lama, dan penambahan alkohol yang tidak benar. Namun kesemuanya tidak masalah lagi jika kita sudah sering melakukannya.

Prosedur Pewarnaan Gram

1. Biakan bakteri dari media padat/ cair ditempelkan di atas gelas objek. Encerkan dengan air destilasi steril. Fiksasi dengan cara melewatkan spesimen di atas api beberapa kali dengan cepat hingga kering. Jangan sampai gelas objek panas. Fiksasi juga dapat dilakukan dengan menambahkan sedikit metanol 95% dan diamkan selama 2 menit.
2. Tambahkan pewarna utama (kristal violet), diamkan selama 1 menit. Bilas sebentar dengan air.
3. Tambahkan larutan Iodin dan diamkan selama 1 menit. Bilas sebentar dengan air.
4. Hilangkan warna dengan peluntur alkohol selama 5 sampai 15 detik lalu bilas sebentar dengan air.
5. Tambahkan cat penutup safranin selama 1 menit. Bilas sebentar dengan air.
6. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x.

Bahan-bahan Untuk Pewarnaan Gram

Berikut ini adalah bahan-bahan yang digunakan untuk pewarnaan gram:

• Pewarna utama: 2 g Crystal violet, 20 mL ethyl alcohol 95%, 0,8 g ammonium oxalate, dan 100 mL air destilasi steril.
• Larutan Iodin: 2 g Kalium Iodida, 1 g iodin kristal, dan 100 mL air destilasi steril.
• Larutan peluntur: 50 mL aseton dan 50 mL etanol 95%.
• Pewarna penutup: 4 g safranin, 200 mL etanol 95%, dan 800 mL air destilasi steril.

Variasi-variasi untuk Bahan Pereaksi Pewarna Gram

Sampai saat ini terdapat banyak variasi pada bahan untuk pewarnaan gram, antara lain:

• Larutan iodin dapat distabilkan dengan polyvinypyrrolidone-iodin.
• Beberapa laboratorium lebih suka menghilangkan warna dengan isopropanol/aseton (3:1 vol:vol).
• Pewarnaan gram di atas biasa disebut sebagai pewarnaan gram 4 langkah. Oleh Mesaros, Army, Strenkoski, dan Leon (www.freepatentsonline.com/5827680.html ), memodifikasi larutan peluntur alkohol dan pewarna penutup dengan menjadikannya 1 larutan. Ini disebut Pewarnaan Gram 3 langkah. Larutan ini dibuat dengan mengkombinasikan 0,40% safranin, 0,30% basic fuchsin, 90% etanol, 10% air distilasi, dan diasamkan hingga pH menjadi 4,5.
• Dimodifikasi oleh Brown dan Brenn (www.library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/MANUALS/MANUALS.html), pewarnaan gram dapat digunakan untuk mendeteksi bakteri gram positif dan gram negatif yang terdapat di dalam jaringan. Melalui metode ini, bakteri gram positif berwarna biru, bakteri gram negatif berwarna merah, dan latar belakangnya berwarna kuning.

Referensi:

Goldman, E. dan L. H. Green. 2009. Practical Handbook of microbiology, 2nd ed. CRC Press.